人类大脑是生物演化的奇迹。准确理解大脑的结构与功能是当前最具挑战性的前沿科学问题，我国亦是将“脑科学”列为了国家重点前沿科技项目。一直以来，人类试图通过各种技术和方法去解释具有共同祖先的四足动物（从早期四足类动物，到现在爬行类、鸟类及哺乳类等陆生动物）如何演化出迥异的大脑特征，为何被视为“低等”的动物大脑具有神奇的再生能力？而作为两栖动物的蝾螈，其大脑部分组织损伤后能重生复原，再生的神经元与损伤前高度相似，且蝾螈是与羊膜动物最接近的近亲之一。这提示利用蝾螈研究脑细胞类型、神经元连接和功能等，有望破解再生修复人类大脑的奥秘，并可能为大脑部分疾病的临床治疗指明方向。
2022年9月2日，由杭州华大生命科学研究院主导，联合来自3个国家17个单位的科学家共同组成的研究团队，基于华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，分析了蝾螈大脑发育和再生过程，构建了首个蝾螈脑再生时空图谱（Science封面：Stereo-seq鉴定蝾螈端脑再生过程中的重要神经干细胞亚型），这项成果以背靠背的形式发表于国际顶刊Science，同期，以特刊的形式，连发了3篇相关文章，深入到细胞层面，聚焦不同细胞类型在大脑演化中扮演的角色，展示了爬行动物和两栖动物大脑演化过程中的关键创新。在此，“华大时空”将陆续推出对其余3篇文章主要内容的解读，敬请关注。
本期推出的是奥地利维也纳生物中心、瑞士苏黎世联邦理工学院等研究团队的一项研究：蝾螈大脑中能否再生出所有细胞类型，包括脑区间的连接？这项研究中，使用snRNA-seq、snATAC-seq和空间转录组等技术来分析蝾螈端脑的细胞多样性，鉴定了蝾螈谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸能神经元，并通过比较分析确定了它们在羊膜动物中的保守性。本研究提供了对四足动物神经系统的组织、进化和再生的新见解。以下是文章的详细解读。
文章题目：Single-Cell Analyses of Axolotl Telencephalon Organization, Neurogenesis, and Regeneration
发表时间：2022-09-02
发表期刊：Science
主要研究团队：奥地利维也纳生物中心、瑞士苏黎世联邦理工学院等
影响因子：63.714
DOI：10.1126/science.abp9262
研究背景
比较不同动物之间的大脑是分析大脑结构的进化起源和多样性的一种手段。scRNA-seq和snRNA-seq提高了脊椎动物脑细胞识别和发育的分辨率。两栖动物墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是与羊膜动物最接近的近亲之一，适合于脑细胞类型、神经元连接和功能的比较研究。蝾螈能够通过激活神经再生来修复背侧区域损伤后的端脑。有神经系统的后生动物都能发现神经发生，成年小鼠室下区的细胞中可以不断进行神经发生，但脑损伤后几乎没有神经发生。蝾螈和哺乳动物神经发生之间的分子关系还未被研究，蝾螈大脑中的动态平衡和再生神经发生之间的异同尚不清楚。因此，研究人员使用单细胞分析稳态和再生期间的蝾螈端脑的细胞类型多样性和稳态神经发生的分子变化。
研究样本
白色墨西哥钝口螈，所有测序实验均使用大小为10~11 cm的蝾螈。
研究策略
使用snRNA-seq、snATAC-seq和空间转录组技术来确定蝾螈端脑的细胞多样性，确定区域分布的神经元、室管膜胶质细胞和神经母细胞；通过比较分析确定它们在羊膜动物细胞中的保守性。使用克隆追踪、轨迹分析和多组学测序来分析蝾螈中稳态神经发生的细胞和分子变化及其与成年小鼠神经发生的关系。通过分析再生神经发生，确定了与稳态神经发生的异同，并发现再生神经元重新建立了来自端脑其他区域的神经元输入。
研究成果
1. 蝾螈端脑的单细胞图谱
研究人员利用显微切割获得端脑内侧、背侧和外侧区域样本，并使用snRNA-seq对这些区域进行分析，通过计算整合了蝾螈的48,136个细胞核，鉴定出95个分子水平不同的神经元和非神经元细胞簇，包括谷氨酸能神经元、γ-氨基丁酸能（GABAergic）神经元、神经胶质细胞和神经母细胞等（图1A、1B）。每种细胞类型都存在于每个显微切割的区域中（图1C），并鉴定出每簇细胞的标记基因（图1D、1E）。研究人员进行了免疫荧光染色和原位RNA杂交链式反应，根据标记定位组织中的主要细胞类型（图1F）；然后分析了每个细胞群在大脑皮层区域的丰度（图1G）。这些数据提供了蝾螈端脑中细胞群的概况，表明了神经发生中的区域特异性。
图1 蝾螈端脑的单细胞图谱
2. 蝾螈端脑谷氨酸能神经元区域的保守性
分析数据显示，29个谷氨酸能神经元簇在内侧、背侧和外侧区域均有分布（图2A、2B）。研究人员通过物种共有的差异表达基因或转录因子来探索蝾螈谷氨酸能神经元的潜在同源性（图2C、2D），并将研究重点放在具有一致相似性的谷氨酸能神经元上。研究人员进行空间转录组研究，得到了大约1~30个细胞的空间分辨率（图2E），发现蝾螈内侧皮层的神经元与羊膜动物海马神经元具有转录相似性。两栖动物大脑皮层的功能之一是处理嗅觉输入，而蝾螈谷氨酸能神经元簇（Glut1）和海龟主要嗅觉输入接受区具有高相关性（图2D）。Glut1中表达Rorb、Reln、Grik1和Tbr1这些相同的标记基因（图2F），通过结合Satb1和Rorb的表达来确定Glut1在背外侧区的位置（图2G），这与空间转录组中的位置一致（图2E）。然后，研究人员通过向Glut1所在区域注射双向示踪剂神经生物素来分析神经投射（图2H）。主嗅球、副嗅球、尾侧大脑皮层（外侧杏仁核）和丘脑中的细胞标记表明，这些区域中的神经元投射到含Glut1的结构域，表明蝾螈端脑具有与羊膜动物嗅皮层转录相似的神经元，并存在嗅觉加工一致的投射。
图2 蝾螈端脑谷氨酸能神经元的保守性
3. GABAergic神经元具有的羊膜动物保守特征
研究人员在蝾螈端脑内鉴定了30个GABAergic神经元簇（n=15,665个细胞；图3A、3B）。在许多脊椎动物中，GABAergic神经元产生于外侧、尾侧和内侧神经节突起（分别为LGE、CGE、MGE），并在发育过程中迁移至大脑皮层。为了解蝾螈GABAergic神经元的保守性，根据保守转录因子的表达，识别LGE样、CGE样和MGE样神经元簇并进行了跨物种比较（图3C、3D），发现蝾螈端脑LGE样纹状体或嗅球类与海龟、小鼠有转录相似性。研究人员根据GABAergic神经元标记基因确定其在大脑皮层的分布（图3E），发现CGE、MGE来源GABAergic细胞群分布于所有区域，LGE来源GABAergic细胞群则主要位于纹状体中，如在羊膜细胞中。总之，这些数据提示蝾螈端脑的GABAergic神经细胞的来源（即细胞迁移和定位）。
图3 蝾螈端脑GABAergic神经元的保守特征
4. 蝾螈端脑中室管膜细胞和神经母细胞的多样性
蝾螈中枢神经系统中的主要神经胶质细胞是室管膜胶质细胞，其在发育、生长和再生中产生神经元。研究人员鉴定了蝾螈端脑室管膜胶质细胞（3,590个细胞）的多样性，并确定了15个转录上不同的细胞簇。将这些细胞簇分为3种类型：静息态（quiescent）、活跃态（active）和前神经室管膜胶质细胞（pro-neuro）（图4A）。静止态细胞不发生增殖，表达内皮素3（Edn3），活跃态细胞表达Notch1且细胞周期评分高，前神经室管膜胶质细胞表达神经元相关基因，如Grin1（图4B、4C）。内侧、背侧和外侧中的室管膜胶质细胞之间存在明显的转录差异（图4C、4D）。在端脑内侧、背侧和外侧检测标记基因表达（图4E）。
研究人员鉴定了神经母细胞，神经母细胞高表达Mex3a，并低表达室管膜胶质细胞标记基因，如Gli2、Aqp4和Kcnj10。15个神经母细胞簇分为两组，分别表达Slc17a6/7 (VGLUT+)或Gad1/2 （GABA+）（图4F）。但与在其他脊椎动物脑中发现的神经母细胞不同，Mex3a+成神经细胞在很大程度上是不增殖的（图4G）。HCR结果显示，所有大脑皮层区域都存在VGLUT+神经母细胞，而GABA+神经母细胞主要存在于纹状体脑室中（图4H）。为了确定蝾螈室管膜胶质细胞和神经母细胞与小鼠神经干细胞和祖细胞的转录相似性，研究人员对成年小鼠数据集（图4I）进行了聚类相关分析和跨物种数据整合，结果表明，蝾螈端脑包含已经表达下游神经元的神经递质信号的神经母细胞群；神经母细胞与小鼠祖细胞和神经母细胞最相似，而室管膜胶质细胞在转录上与小鼠室管膜细胞和神经干细胞最为相似。
图4 蝾螈端脑室管膜胶质细胞和神经母细胞的多样性
5. 胚胎发育后谷氨酸能神经发生的转录变化
研究人员使用Cre-loxP介导的示踪法标记室管膜胶质细胞，以研究它们的再生特性，并确定它们在胚胎后神经发生期间的克隆模式（图5A），这揭示了内侧、背侧和外侧区域不同的神经发生模式。内侧和背侧克隆是连续的堆积生长模式，而外侧克隆是神经元迁移模式。使用RNA速率轨迹推断蝾螈胚胎后神经发生的细胞和分子变化，构建了代表不同区域特异性神经发生的轨迹（图5B、5C）。所有的轨迹都起源于活跃态室管膜胶质细胞，并且海马神经元簇、外侧皮质簇都含有神经母细胞中间体，但背内侧神经元簇则没有，因此推断其起源于前神经室管膜胶质细胞。研究人员鉴定了拟时序特异性变化表达的基因（图5D）。
为了解决谷氨酸能神经发生的基因调控关系，对蝾螈整个大脑皮层进行单核多组学测序，评估基因调控区的差异染色质可及性（图5E、5F）。大多数谷氨酸能神经元簇特异性基因的调控元件在轨迹早期已经在相应的神经母细胞簇中获得了染色质可及性。通过结合基因表达、染色质可及性和转录因子（TF）结合基序构建出基因调控网络（gene regulatory network，GRN）。GRN的UMAP嵌入揭示了不同的TF组，对应于从室管膜胶质细胞向谷氨酸能神经元的转变（图5G）。为了更好地理解基因调控在神经元轨迹之间的差异，进行差异可及性分析，确定了每个轨迹中富集的调控区域并构建出反映轨迹特异性调控特征的GRN子网络（图5H），从而识别出具有高中心性的TF，如海马中的Nr3c2、Foxo3和Mef2a（图5I）。总之，这些数据构建了蝾螈端脑神经元多样化的调节关系。
图5 谷氨酸能神经发生的转录变化
6. 蝾螈端脑再生的分子变化
为了研究蝾螈端脑再生过程中的细胞和分子变化，研究人员使用Div-Seq技术，其将snRNA-seq与S期细胞的EdU标记相结合。研究人员损伤蝾螈端脑的背侧区域（包括Satb1+和Rorb+结构域），并在损伤后第2、5、12、19和26 d用EdU标记细胞，在整个再生过程中收集EdU+细胞进行Div-Seq（图6A）。为了观察再生过程中EdU+细胞的位置，研究人员在再生脑中对EdU进行了荧光标记（图6B）。接下来，研究人员研究了再生过程中EdU+细胞的转录组，以稳态数据作为参考确定所有主要的细胞类型（图6C）。每种细胞类型在整个再生过程中以不同的比例出现（图6D）。在损伤后1周，活跃态室管膜胶质细胞构成了大多数EdU+细胞，而在损伤后2周和4周，神经母细胞是最丰富的细胞类型。从损伤后6周开始，大多数EdU+细胞是谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元。
为了解端脑损伤是否诱导室管膜胶质细胞转录组变化，研究人员通过整合和聚类两个数据集，并评估不同时间点每个聚类中的差异丰度和表达，比较了DivSeq和稳态室管膜胶质细胞（图6E）。研究人员发现三个细胞簇（簇8、20和21）在损伤后1周和2周强烈富集，在以后的时间点和稳定状态下很少或不存在（图6F）。簇21细胞差异表达基因如Kazald1、Runx1等与伤口愈合和细胞粘附相关，表明对损伤的早期反应程序（图6F~H）。Kazald1和Runx1的染色证实，在未损伤的端脑中没有表达，在损伤后1周的端脑中有较强的表达（图6I）。
Div-Seq的神经母细胞和神经元的投影和分类显示，大多数稳态细胞在再生期间重建（图6J）。HCR染色证明了损伤后4~8周之间Satb1+、Rorb+谷氨酸能神经元的恢复（图6K）。然后，使用轨迹分析确定了再生和稳态神经发生轨迹之间的高度相似性（图6L、6M）。最后，为了确定再生的Satb1+、Rorb+神经元结构域是否重建投射，研究人员将神经生物素注射到未损伤和再生脑中的Satb1+、Rorb+区域，并进行整体免疫组织化学以鉴定细胞体和突起。与未受伤的大脑类似，染色的细胞体位于嗅球、副嗅球和尾端端脑（杏仁核）中，表明来自这些区域的输入在受伤再生的端脑中重建（图6N）。
图6 蝾螈端脑再生的分子变化
结论
本研究结果表明，与哺乳动物端脑区域相关的细胞类型和基因表达模式在两栖动物的大脑中存在。在蝾螈中，端脑神经发生通过不同的神经母细胞祖细胞进行，这些祖细胞与特定的神经元类型相关，并依赖于共有且特定的调节程序。在再生神经发生中存在这些相同的程序，表明脑损伤在诱导损伤特异性室管膜细胞状态后通过相同途径激活神经发生，再生的神经元重新建立与大脑远端区域的连接。本研究对蝾螈大脑如何再生的见解可能会为其他生物的大脑再生研究提供信息。
系列导读
● 文献解读 | Science封面：Stereo-seq鉴定蝾螈端脑再生过程中的重要神经干细胞亚型
●Science | MERFISH揭示人和小鼠大脑皮层细胞的保守性和差异性
●Nat Neurosci | 单细胞原位转录组图谱揭示哺乳动物大脑皮层中星形胶质细胞分层
● Nature Neuroscience | 小鼠大脑星形胶质细胞异质性炎症响应的时空图谱
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